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　　本发明针对传统纤维素酶生产过程中产率低的问题，提出了一种新的发酵工艺。该方法通过对里氏木霉CCIC13052在不同生长阶段进行温度、溶氧和pH值的精确控制，并定期添加微晶纤维素作为底物，显著提高了纤维素酶的产量。实验结果表明，使用本发明的方法比传统方法产率提升了约64.9%。

　　【专利摘要】本发明公开了一种提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，包括获取菌种以及将获取的菌种接种到发酵培养基中进行发酵获得纤维素酶，在纤维素酶发酵过程中，根据菌体快速生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整。本发明工艺打破了传统发酵方法的比较粗放的方法，提出了分段控制发酵过程参数，建立了细致的补料工艺。有效的为产酶提供良好的条件，很大提高了纤维素酶的生产水平，节省成本，适合大规模工业化生产。

　　[0001]本发明涉及纤维素酶的发酵生产【技术领域】，主要涉及到一种提高纤维素酶生产水平的发酵工艺。

　　[0002]纤维素酶是一种多用途酶，它在食品、纺织、造纸、能源、饲料等领域已有广泛的应用，特别是生物质能源方面。因此针对纤维素酶的研究成为了战略性的课题。

　　[0003]纤维素酶是一种复合酶系，由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶组成。纤维素酶的生产菌株有细菌、真菌、放线菌，目前纤维素酶的生产方式主要采用发酵的方法获得，其中以里氏木霉菌株液态发酵最为广泛。针对纤维素酶发酵生产工艺，研究人员已经进行了广泛的研究，最初的纤维素酶发酵过程中发酵体系的温度基本不变，且溶氧和PH值条件都是最初设置好后就不再进行人工干预，事实上，因为在发酵过程中菌体的生长的生理活动导致发酵体系的温度、溶氧和pH值后期都会发生一些变化，这些变化对发酵过程不一定是有利的，基于此，专利号为2.3的“一种提高利用木霉菌生产酸性纤维素酶的产量的生产方法”已经对纤维素酶发酵过程中的pH值进行了初步的人工调整，也得到了有益的效果。

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　　[0004]鉴于此，本发明通过对里氏木霉发酵过程的深入研究，提出了分段控制发酵过程参数，建立了细致的补料工艺。有效的为产酶提供良好的条件，提高了纤维素酶的生产水平。该工艺同时也 适合大规模工业化生产。

　　[0005]本发明的目的在于提供一种提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，用于高效产生纤维素酶。本发明对微生物的代谢规律进行研究，根据发酵纤维素酶的菌种的菌体快速生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件比如温度、溶氧和发酵体系中纤维素含量等按照发酵时间进行分段调整，达到提高纤维素酶产量的目的。

　　[0007]—种提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，包括获取菌种以及将获取的菌种接种到发酵培养基中进行发酵获得纤维素酶，在纤维素酶发酵过程中，在发酵开始后的前36~48h为菌种的菌体快速生长期，在开始发酵后的36~48h直至发酵结束为菌种的菌体稳定期，根据菌体快速生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整:

　　[0008]在发酵开始后的前36~48h内发酵体系温度调高为27~29°C，之后发酵体系温度调低为25~27°C，直至发酵结束；

　　[0009]在发酵开始后的前24~36h内发酵体系中溶氧调高为40~70%，之后发酵体系中溶氧调低为20%~50%，直至发酵结束；

　　[0010]在发酵开始后的第18~48h和在发酵开始后的第72~132h两个时间段内向所述发酵体系内缓慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速为8~16mL/min，所述葡萄糖溶液的浓度为200~400g/L。

　　[0012](3)获取菌种:将所述菌种接种到种子培养基中进行培养得种子培养液；

　　[0013](4)将菌种的所述种子培养液按照体积比为1: 25~3: 50的比例接种到发酵罐的发酵培养基中制成发酵体系，以纤维素为底物开始纤维素酶发酵。

　　[0014]优选的是，在发酵开始后的前36~48h内发酵体系温度调高为28°C，之后发酵体系温度调低为26°C，直至发酵结束。

　　[0015]优选的是，在发酵开始后的前24~36h内发酵体系中溶氧调高为50%，之后发酵体系中溶氧调低为30%，直至发酵结束。

　　[0016]优选的是，在纤维素酶发酵过程中的35~45h内发酵体系pH值调高为4.8~5.2，之后发酵体系pH在35~45h到55~65h调低为4.3~4.7,之后,在纤维素酶发酵过程的第55~65h直至发酵结束再将发酵体系的pH调高为4.8~5.2。

　　[0017]优选的是，在纤维素酶发酵过程中的35~45h内发酵体系pH值调高为5.0，之后发酵体系pH在35~45h到55~65h调低为4.5,之后,在纤维素酶发酵过程的第55~65h直至发酵结束再将发酵体系的PH调高为5.0。

　　[0018]优选的是，在纤维素酶发酵开始后24~132h内每隔6_12h填加纤维素一次，纤维素添加方法为:

　　[0019](I)将纤维素与水混合成浓度为150~300g/L的纤维素和水的混合液；

　　[0020](2)按所述混合液与发酵体系的体积比为1: 15~1: 50向所述发酵体系中添加所述混合液。

　　[0022]优选的是，所述纤维素酶发酵开始后的90~IOOh之后，每隔10~14h抽样检测所述发酵体系的滤纸酶活一次，直至两次抽样检测所述发酵体系的滤纸酶活不再增加时结束所述纤维素酶发酵过程。

　　[0024]本发明的有益效果是本发明通过对里氏木霉发酵过程的深入研究，提出了提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，包括菌种培养和纤维素酶发酵，其中，所述纤维素酶发酵过程为:将培养后的菌种培养液按照体积比为1: 25~3: 50的比例接种到发酵罐的发酵培养基中制成发酵体系开始纤维素酶发酵；在纤维素酶发酵过程中按时间分段调控发酵体系的温度、溶氧、PH以及添加纤维素和添加葡萄糖。本发明工艺打破了传统发酵方法的比较粗放的方法，提出了分段控制发酵过程参数，建立了细致的补料工艺。有效的为产酶提供良好的条件，很大提高了纤维素酶的生产水平，节省成本，适合大规模工业化生产。

　　[0025]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

　　[0026]本发明中所用的菌种里氏木霉(Trichoderma reesei CCIC13052)ATCC56765由中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)购得。[0027]本发明所述提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，包括获取菌种以及将获取的菌种接种到发酵培养基中进行发酵获得纤维素酶，在纤维素酶发酵过程中，在发酵开始后的前36~48h为菌种的菌体快速生长期，在开始发酵后的36~48h直至发酵结束为菌种的菌体稳定期，根据菌体快速生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整:

　　[0028]在发酵开始后的前36~48h内发酵体系温度调高为27~29°C，之后发酵体系温度调低为25~27°C，直至发酵结束；

　　[0029]在发酵开始后的前24~36h内发酵体系中溶氧调高为40~70%，之后发酵体系中溶氧调低为20%~50%，直至发酵结束；

　　[0030]在发酵开始后的第18~48h和在发酵开始后的第72~132h两个时间段内向所述发酵体系内缓慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速为8~16mL/min，所述葡萄糖溶液的浓度为200~400g/L。

　　[0031]所述纤维素酶发酵工艺包括:[0032](I)获取菌种:将所述菌种接种到种子培养基中进行培养得种子培养液；

　　[0033](2)将菌种的所述种子培养液按照体积比为1: 25~3: 50的比例接种到发酵罐的发酵培养基中制成发酵体系，以纤维素为底物开始纤维素酶发酵。

　　[0034]在发酵开始后的前36~48h内发酵体系温度调高为28°C，之后发酵体系温度调低为26°C，直至发酵结束。

　　[0035]在发酵开始后的前24~36h内发酵体系中溶氧调高为50%，之后发酵体系中溶氧调低为30%，直至发酵结束。

　　[0036]在纤维素酶发酵过程中的35~45h内发酵体系pH值调高为4.8~5.2，之后发酵体系pH在35~45h到55~65h调低为4.3~4.7,之后,在纤维素酶发酵过程的第55~65h直至发酵结束再将发酵体系的pH调高为4.8~5.2。

　　[0037]在纤维素酶发酵过程中的35~45h内发酵体系pH值调高为5.0，之后发酵体系pH在35~45h到55~65h调低为4.5,之后,在纤维素酶发酵过程的第55~65h直至发酵结束再将发酵体系的pH调高为5.0。

　　[0038]在纤维素酶发酵开始后24~132h内每隔6_12h填加纤维素一次，纤维素添加方法为:

　　[0039](I)将纤维素与水混合成浓度为150~300g/L的纤维素和水的混合液；

　　[0040](2)按所述混合液与发酵体系的体积比为1: 15~1: 50向所述发酵体系中添加所述混合液。

　　[0042]所述纤维素酶发酵开始后的90~IOOh之后，每隔10~14h抽样检测所述发酵体系的滤纸酶活一次，直至两次抽样检测所述发酵体系的滤纸酶活不再增加时结束所述纤维素酶发酵过程。

　　[0046]纤维素酶活力测定[0047]本发明涉及的酶活力测定为滤纸酶活。

　　[0048]本发明涉及的各种酶活力同意定义为:lmin水解底物产生相当于Ιμπιο?葡萄糖的还原糖量所需要的酶的量为一个酶活力单位，用IU表示。

　　[0050]滤纸酶活力的测定方法:1ml粗酶液，在50±0.1°C，ρΗ4.8的条件下，水解50± Img滤纸Ih所产生的还原糖的量，用DNS法测定还原糖的生成量。

　　[0052](1)菌种获取:将里氏木霉(Trichoderma reesei CICC13052)菌株接种于PDA斜面,于30°C恒温培养箱中培养6d。然后将PDA斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为2 X IO7个/mL的抱子悬液，按照3%的接种量接种于新鲜的种子培养基中，于28°C，转速180转/分的摇床上震荡培养。

　　[0053](2)将培养24h后的种子液按照5%接种量接种至新鲜的发酵培养基中(5L发酵罐装液量为2.5L)进行培养，在纤维素酶发酵过程中，在发酵开始后的前36~48h为菌种的菌体快速生长期，在开始发酵后的36h直至发酵结束为菌种的菌体稳定期，根据菌体快速生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整:

　　[0054]在发酵开始后的前36h内发酵体系温度为27°C，之后发酵体系温度调低为25V,直至发酵结束；

　　[0055]在发酵开始后的前24h内发酵体系中溶氧为40%，之后发酵体系中溶氧调低为20%，直至发酵结束；

　　[0056]在发酵开始后的第18~36h和在发酵开始后的第72~84h两个时间段内向所述发酵体系内缓慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速为8mL/min，所述葡萄糖溶液的浓度为200g/L ；

　　[0057]在纤维素酶发酵过程中的35h内发酵体系pH值为4.8，之后发酵体系pH在35h到55h调低为4.3，之后，在纤维素酶发酵过程的第55~65h直至发酵结束再将发酵体系的pH调闻为4.8 ;

　　[0058]在纤维素酶发酵开始后24~132h内每隔6h填加纤维素一次，纤维素添加方法为:将纤维素与水混合成浓度为150g/L的纤维素和水的混合液；之后向2.5L发酵培养基中加入50mL纤维素混合液；

　　[0059]发酵160h结束，采用国际理论与应用化学联合会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，得到滤纸酶活为20.68IU/mL。

　　[0062]种子培养基组成为:微晶纤维素2 玉米浆I %，葡萄糖I %，调节pH为4.5。

　　[0064]另外，以生产阶段中对发酵过程不进行控制的情况作为空白实验，经比较，采用本发明方法进行纤维素酶发酵之后获得滤纸酶活相对于空白试验的滤纸酶活为14.2IU/mL提闻了 45.6 。

　　[0065]实施例3[0066](I)菌种获取:将里氏木霉(Trichoderma reesei CICC13052)菌株接种于PDA斜面,于30°C恒温培养箱中培养6d。然后将PDA斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为2 X IO7个/mL的抱子悬液，按照3%的接种量接种于新鲜的种子培养基中，于28°C，转速180转/分的摇床上震荡培养。其中，种子培养基组成为:微晶纤维素2%，玉米浆1%，葡萄糖1%，调节pH为4.5。

　　[0067](2)将培养24h后的种子液按照5%接种量接种至新鲜的发酵培养基中(5L发酵罐装液量为2.5L)进行培养，在纤维素酶发酵过程中，在发酵开始后的前36~48h为菌种的菌体快速生长期，在开始发酵后的36~48h直至发酵结束为菌种的菌体稳定期，根据菌体快速生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整:

　　[0068]在发酵开始后的前36~48h内发酵体系温度为28°C，之后发酵体系温度调低为26°C，直至发酵结束；

　　[0069]在发酵开始后的前24~36h内发酵体系中溶氧为50%，之后发酵体系中溶氧调低为30%，直至发酵结束；

　　[0070]在发酵开始后的第18~48h和在发酵开始后的第72~132h两个时间段内向所述发酵体系内缓慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速分别为12mL/min和10mL/min，所述葡萄糖溶液的浓度为300g/L ；

　　[0071]在纤维素酶发酵过程中的35~45h内发酵体系pH值为5.0，之后发酵体系pH在35~45h到55~65h调低为4.5,之后,在纤维素酶发酵过程的第55~65h直至发酵结束再将发酵体系的pH调高为5.0 ; [0072]在纤维素酶发酵开始后24~132h内每隔6_12h填加纤维素一次，纤维素添加方法为:将纤维素与水混合成浓度为250g/L的纤维素和水的混合液；之后向2.5L发酵培养基中加入IOOmL纤维素混合液；

　　[0073]发酵168h结束，采用国际理论与应用化学联合会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，得到滤纸酶活为23.42IU/mL。

　　[0077]另外，以生产阶段中对发酵过程不进行控制的情况作为空白实验，经比较，采用本发明方法进行纤维素酶发酵之后获得滤纸酶活相对于空白试验的滤纸酶活为14.2IU/mL提闻了 64.9 。

　　[0079](I)菌种获取:将里氏木霉(Trichoderma reesei CICC13052)菌株接种于PDA斜面,于30°C恒温培养箱中培养6d。然后将PDA斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为2 X IO7个/mL的抱子悬液，按照3%的接种量接种于新鲜的种子培养基中，于28°C，转速180转/分的摇床上震荡培养。其中，种子培养基组成为:微晶纤维素2%，玉米浆1%，葡萄糖1%，调节pH为4.5。

　　[0080](2)将培养24h后的种子液按照5%接种量接种至新鲜的发酵培养基中(5L发酵罐装液量为2.5L)进行培养，在纤维素酶发酵过程中，在发酵开始后的前36~48h为菌种的菌体快速生长期，在开始发酵后的36~48h直至发酵结束为菌种的菌体稳定期，根据菌体快速生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整:

　　[0081]在发酵开始后的前36~48h内发酵体系温度调高为29°C，之后发酵体系温度调低为25~27°C，直至发酵结束；[0082]在发酵开始后的前24~36h内发酵体系中溶氧调高为70%，之后发酵体系中溶氧调低为50%，直至发酵结束；

　　[0083]在发酵开始后的第18~48h和在发酵开始后的第72~132h两个时间段内向所述发酵体系内缓慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速为16mL/min，所述葡萄糖溶液的浓度为200~400g/L ；

　　[0084]在纤维素酶发酵过程中的35~45h内发酵体系pH值为5.2，之后发酵体系pH在35~45h到55~65h调低为4.7,之后,在纤维素酶发酵过程的第55~65h直至发酵结束再将发酵体系的pH调高为5.2 ;

　　[0085]在纤维素酶发酵开始后24~132h内每隔6_12h填加纤维素一次，纤维素添加方法为:将纤维素与水混合成浓度为300g/L的纤维素和水的混合液；之后向2.5L发酵培养基中加入150mL纤维素混合液；

　　[0086]发酵150h结束，采用国际理论与应用化学联合会(IUPAC)推荐的国际标准方法测定发酵液酶活，得到滤纸酶活为22.34IU/mL。

　　[0090]另外，以生产阶段中对发酵过程不进行控制的情况作为空白实验，经比较，采用本发明方法进行纤维素酶发酵之后获得滤纸酶活相对于空白试验的滤纸酶活为14.2IU/mL提闻了 57.3 。

　　[0091]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

　　1.一种提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，包括获取菌种以及将获取的菌种接种到发酵培养基中进行发酵获得纤维素酶，在纤维素酶发酵过程中，在发酵开始后的前36~48h为菌种的菌体快速生长期，在开始发酵后的36~48h直至发酵结束为菌种的菌体稳定期，根据菌体快速生长期和菌体稳定期生长状况的不同对发酵条件按照发酵时间进行分段调整:在发酵开始后的前36~48h内发酵体系温度为27~29°C，之后发酵体系温度调低为25~27°C，直至发酵结束；在发酵开始后的前24~36h内发酵体系中溶氧为40~70%，之后发酵体系中溶氧调低为20%~50%，直至发酵结束；在发酵开始后的第18~48h和在发酵开始后的第72~132h两个时间段内向所述发酵体系内缓慢添加葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液添加流速为8~16mL/min，所述葡萄糖溶液的浓度为200~400g/L。

　　2.如权利要求1所述的提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，包括:(1)获取菌种:将所述菌种接种到种子培养基中进行培养得种子培养液；(2)将菌种的所述种子培养液按照体积比为1: 25~3: 50的比例接种到发酵罐的发酵培养基中制成发酵体系，以纤维素为底物开始纤维素酶发酵。

　　3.如权利要求2所述的提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，在发酵开始后的前36~48h内发酵体系温度为28°C，之后发酵体系温度调低为26°C，直至发酵结束。

　　4.如权利要求3所述的提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，在发酵开始后的前24~36h内发酵体系中溶`氧为50 %，之后发酵体系中溶氧调低为30 %，直至发酵结束。

　　5.如权利要求4所述提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，在纤维素酶发酵过程中的35~45h内发酵体系pH值调高为4.8~5.2，之后发酵体系pH在35~45h到55~65h调低为4.3~4.7，之后，在纤维素酶发酵过程的第55~65h直至发酵结束再将发酵体系的PH调高为4.8~5.2。

　　6.如权利要求5所述提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，在纤维素酶发酵过程中的35~45h内发酵体系pH值为5.0,之后发酵体系pH在35~45h到55~65h调低为4.5，之后，在纤维素酶发酵过程的第55~65h直至发酵结束再将发酵体系的pH调筒为5.0 ο

　　7.如权利要求6所述的提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，在纤维素酶发酵开始后24~132h内每隔6-12h添加纤维素一次，纤维素添加方法为:(1)将纤维素与水混合成浓度为150~300g/L的纤维素和水的混合液；(2)按所述混合液与发酵体系的体积比为1: 15~1: 50向所述发酵体系中添加所述混合液。

　　8.如权利要求7所述的提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，所述纤维素为微晶纤维素。

　　9.如权利要求1~8中任一项所述的提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，所述纤维素酶发酵开始后的90~IOOh之后，每隔10~14h抽样检测所述发酵体系的滤纸酶活一次，直至两次抽样检测所述发酵体系的滤纸酶活不再增加时结束所述纤维素酶发酵过程。

　　10.如权利要求9所述的提高纤维素酶生产水平的发酵工艺，其特征在于，所述菌种为里氏木霉CCIC13 052。

　　【发明者】李晨, 张东远, 马立娟, 赫荣琳, 贾文娣, 张粲, 陈树林 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所

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