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　　合成酶等的合成，同时也是部分产酸细菌的重要组成部分，在产酸代谢过程中发挥着重要作用。

　　目前，有研究指出发酵体系中直接补充微量元素有利于提高水解酸化效率，但其补充量在不同发酵体系中差异巨大，这是因为微量元素多变的化学形态以及不同的生物利用度引起的。ORTNER等的研究表明，Ni会与S2、CO32、PO42等离子发生沉淀等复杂的化学反应，由此导致相当一部分(约40%)无法被利用。近期研究者开始关注通过提高生物利用度优化微量元素投加量的相关研究。ZHANG等的研究表明乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、次氮基三乙酸(NTA)可以提高产甲烷过程中Ni的生物利用度。CAI等的研究证实了EDTA-Fe的补充既能在产酸期提高生物质向VFA的转化效率，也能在产甲烷阶段增强VFA向甲烷的转化效率。ZHONG等的研究亦指出EDTA-Ni可以通过提高水溶性Ni的比例来强化产甲烷过程。利用EDDS、NTA、EDTA等人工合成螯合剂提高微量元素的水溶态和离子交换态等可生物利用形态已经得到了初步验证。而胞外聚合物(extracellularpolymericsubstances，EPS)作为一种微生物分泌的天然有机物，拥有与人工合成螯合剂相似的官能团，LIU等分析了EPS的质子结合位点的强度，证实了EPS中羧基、磷酸基、羟基和氨基的存在，这些基团与微量元素有较好的螯合性能，因而有望成为提高微量元素生物利用度和减少投加量的绿色物质。

　　目前对螯合剂提高Ni生物利用度的研究多集中于厌氧消化产甲烷阶段中，对于水解产酸过程的影响并不清晰，由于人工螯合剂存在价格和环境风险的问题，本研究考虑利用EPS作为Ni的螯合剂，并与人工螯合剂进行对比，从产酸效能、Ni生物利用度和微生物群落分布的角度综合评价FW厌氧发酵产酸体系中螯合剂-Ni共同补充后对水解酸化过程的增促效应和机理。

　　为了保证各批所用物料的一致性，本实验采用模拟厨余垃圾。根据国内典型的厨余垃圾组成，结合课题组前期研究结论，模拟厨余垃圾比例确定为：芹菜20%、土豆30%、香蕉皮20%、米饭20%、豆腐5%、猪肉5%。混合物料经过机械破壁机破碎后冷藏备用。模拟厨余垃圾的基本性质详见表1。

　　本实验所用的接种物来自某餐厨垃圾厌氧处理厂的中温消化污泥，经24h沉降后取下层的浓缩污泥用于实验。污泥的基本性质详见表1。污泥中Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Mn、Mo的含量分别为3.28×103、3.23、8.19、707、276、168、1.56mg·kg-1。EPS来源于接种污泥，用加热法提取然后冷冻干燥制成粉末用于Ni的螯合。

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　　污泥和FW以VS质量比1∶6混合，控制TS=4%，温度调控为37℃，在有效体积为400mL的厌氧小瓶中进行发酵，反应开始前通入N2吹扫2min以保证厌氧环境。Ni以(NiCl2·6H2O)的形式投加。实验首先通过添加1.25、2.5、5、10、15mg·L1的Ni来确定最佳质量浓度，发酵时间7d。在此基础上，进行50%最优质量浓度-螯合剂对FW水解酸化的强化实验。Ni-螯合实验共有9组，包括对照组、EPS对照组、Ni-50%最优质量浓度组、Ni-最优质量浓度组、EDDS、EDTA、NTA、CA-Ni-50%最优质量浓度组。将Ni∶螯合剂按1∶1混合，为防止光降解在黑暗中搅拌12h制成配合物，然后将其放入反应器中，另取一份EPS-Ni螯合物冷冻干燥后扫描傅里叶红外光谱。

　　总固体含量(TS)、挥发性固体含量(VS)按标准方法分析。pH由pH计(PHS-3C型，上海雷刺仪器)测定。SCOD采用分光光度法(5B-3B，北京连华科技)测定。溶解态蛋白质和碳水化合物通过Lowry-Folin法和蒽酮-硫酸法测定。采用气相色谱法(GC-2030，日本岛津)测定VFAs质量浓度，包括乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸和异戊酸。为了便于计算，通常把VFA转化成COD，它们的COD当量转化系数分别为1.066、1.512、1.816、1.816、2.036、2.036g·L1。傅里叶红外光谱图样品采用溴化钾压片法制备。

　　采用顺序提取法评估Ni的形态。通过电感耦合等离子质谱仪(ICAPRQ,美国ThermoFisherScientific)分析每个萃取步骤的Ni质量浓度。

　　研究了不同Ni质量浓度对水解产酸效果的影响，如图1所示，SCOD和VFA质量浓度(均以VS计)均在3~4d基本趋于稳定。FW中的发酵基质主要是碳水化合物和蛋白质，反应1~3d水解产酸菌快速降解发酵底物，溶解态碳水化合物和蛋白质的质量浓度(均以VS计)快速降低，至反应结束时，碳水化合物和蛋白质分别降解了62.4%~65.1%、24.7%~29.9%，可能是因为发酵底物中碳水化合物的质量浓度明显高于蛋白质，这也与STRAZZERA等的研究结论相似，表明碳水化合物是比蛋白质更有效的产酸基质。1.25、2.5、5mg·L1的Ni对水解酸化过程有一定的促进作用，而当Ni质量浓度为10、15mg·L1时相比于对照组出现了明显的抑制作用，并且Ni质量浓度越高，抑制作用越强。SCOD和VFA均在Ni-2.5mg·L1条件下呈现出最高质量浓度，比对照组分别提高了23.0%和35.4%。由此可知，Ni对水解产酸的作用也呈现出典型的“低促高抑”现象，这与之前GUO等和MUDHOO等的研究结果相似，低质量浓度Ni对于水解产酸同样具有促进作用。

　　在水解产酸效果最优Ni质量浓度(2.5mg·L1)和次优Ni质量浓度(1.25mg·L1)的基础上，以次优Ni质量浓度(1.25mg·L1)为基数与5种螯合剂EDDS、EDTA、NTA、CA、EPS分别1∶1螯合，进一步研究螯合剂-Ni对FW水解酸化的影响以及利用螯合剂降低Ni用量的可行性。不同螯合剂-Ni对水解酸化的影响如图2所示，结果表明SCOD质量浓度和VFA产量(均以VS计)基本都在第4天达到稳定。5种螯合剂的加入使SCOD质量浓度相较于对照组分别提高了20%~27%，其中EDTA、EDDS和CA组与Ni-1.25mg·L1组相比没有显著差异，而NTA、EPS组显著优于Ni-1.25mg·L1组(P=0.0001)，提高了6.2%。螯合剂的加入还使VFA产量相较于对照组分别提高了27%~43%，其中EDTA、EDDS、NTA组显著优于Ni-1.25mg·L1组，与Ni-2.5mg·L1组相比没有显著差异；而EPS组相比Ni-1.25mg·L1组和Ni-2.5mg·L1组分别提高了16.6%和5.7%，均有显著性差异(P=0，P=0.0037)。由此可知，人工螯合剂和EPS对于强化产酸效率和减少Ni用量均有明显的效果，在保证VFA产量的条件下至少能够有效减少50%的Ni用量，之前关于人工螯合剂的研究表明，EDTA、EDDS、NTA与TE螯合后都能在减少50%TE用量的情况下提高甲烷产率，本研究结果证明，螯合剂对于水解产酸过程有同样的效果，并且天然螯合剂EPS可以起略优于人工螯合剂的作用。

　　从上述结论可以得出EPS-Ni组表现出了最优的产酸效果，为了识别是EPS有机构成的影响还是EPSNi螯合功能的影响，本实验设置了只添加EPS的对照组，结果发现单独添加EPS时VFA产量并没有显著提高，同时利用EPS对照组的提升进行换算，VFA产量的提高中，81.4%是EPS-Ni螯合之后对Ni生物利用度的贡献，而仅有18.6%可能是来自于EPS本身复杂的生化功能，由此推测EPS与Ni的螯合作用才是强化FW水解产酸的主要原因。

　　此外，图3评价了不同螯合剂对转化效率的影响及各组之间的显著性差异。除EDDS、CA外，EDTA、NTA、EPS对于水解率和酸化率的提高效果均优于同等Ni质量浓度(1.25mg·L1)，EPS和NTA的水解率和酸化率能与最优Ni质量浓度(2.5mg·L1)基本持平，没有显著差异，EDTA和NTA之间也没有显著差异，这与SCOD质量浓度和VFA产量情况基本一致。综上表明EDTA、NTA、EPS-Ni的加入可以有效提高FW水解酸化效率，同时降低50%的Ni用量。故利用这3种螯合剂，选择发酵初期(0d)、产酸峰值(4d)、发酵末期(7d)进行系统的碳平衡分析，如图4所示。随着发酵的进行，发酵底物中的碳水化合物和蛋白质比例大幅降低，分别从63.1%~66.7%和29.5%~31.6%降到8%~10%。VFA的比例明显增加，且VFA主要以乙酸和丁酸为主，还包含少量丙酸，属于丁酸型发酵。从4d到7d，VFA总比例基本持平，戊酸是由乙酸、丙酸、丁酸进一步合成的产物，在发酵末期乙酸比例减少，开始出现少量戊酸。由此可知，添加Ni和螯合剂，不会对VFA的种类和比例产生影响，但能明显提高系统的产酸效率。对比不同FW发酵体系的VFA产值，前人研究在基于pH调控基础下的VFA产值能达到0.3~0.4g·g1(以TS计)，本研究利用EPS-Ni作为螯合剂就可以使VFA产值可以达到0.3g·g1，验证了EPSNi补充对酸性条件(pH=4~5)产酸发酵体系的有效性。

　　在厌氧产酸体系中，Ni的化学形态受环境因素而发生变化，进而影响Ni的生物利用度。EDTA和NTA都属于氨基羧酸类螯合剂，ZHANG等的研究和ZHONG等的研究均已证明了EDTA、NTA与Ni螯合后补充到厌氧体系中可以有效提高Ni的生物利用度。而EPS中有着丰富的官能团结构，与Ni存在一定的络合作用，图5对比了EPS与Ni螯合前后的傅里叶红外光谱图。在EPS谱图中，3420cm1的吸收峰是由于蛋白质氨基(-NH)或葡萄糖羟基(-OH)基团伸缩振动引起的，2994cm1处是烷基(-CH)的特征吸收峰，1570cm1的吸收峰被认为是蛋白质羧基(C=O)基团的伸缩振动，1415cm1的吸收峰可能是由羧基(C-O)伸缩振动引起，也可能对应于-CH2、-CH3的弯曲振动，而小于1000cm1的吸收峰通常被归入磷酸基团。EPS与Ni螯合后，光谱图中3420、2994、1570、1415cm1的吸收峰分别变成了3450、2957、1583、1397cm1，这些变化表明EPS的氨基、羧基、羟基是与Ni结合的主要因素。

　　为了进一步评价EPS-Ni投加后对Ni化学形态的影响，采用顺序提取法提取Ni的各种化学形态，再利用这5种化学形态的含量来进行核算，评价Ni在产酸发酵体系中的生物利用度。F1代表水溶态，可以快速直接被微生物利用，具有最高的生物利用度；F2代表可交换态，最容易迁移和转化为F1，也有助于生物利用度；F3可还原态，对pH敏感，当pH下降时很容易释放到F2中；F4可氧化态，通常是通过吸附形成的，不容易被微生物利用；最后是F5残留态，其中的Ni不溶于微生物，不能被微生物利用。从F1~F5，生物利用度逐级降低。选取水解酸化效果最优的3种螯合剂EDTA、NTA、EPS组，与单独加Ni1.25mg·L1组，取产酸达到稳定峰值的第4d发酵条件下的混合液，利用顺序提取法提取其中的5种化学形态的Ni并进行含量分析，如图6所示。Ni-1.25mg·L1组中的F1为44.7%，EDTA-Ni、NTA-Ni、EPSNi组的F1分别提高到56.5%、59.5%、72.6%。F2中的Ni也是较容易被生物利用的，EDTA-Ni、NTANi、EPS-Ni组的F1和F2组分之和分别是Ni-1.25mg·L1组(55.6%)的1.18、1.19、1.49倍。同时，与螯合剂-Ni相比，Ni-1.25mg·L1组中生物利用率最低的2个组分F4和F5之和最高，为24.1%。因此，加入螯合剂-Ni与单独加Ni相比，有效提高了Ni的生物利用度，这与之前的研究结果一致，并且在本研究中EPS对于生物利用度的提升效率明显优于EDTA和NTA，这与VFA产量情况一致。不同螯合剂的情况有差异，这是由于螯合剂对Ni的络合能力不同。络合能力过强不利于Ni的释放，影响微生物的吸收。络合能力太弱可能无法阻止Ni与S2的沉淀。LI等的研究认为，EPS中的羟基和氨基是与Ni络合的关键基团，上述EPS与Ni螯合的傅里叶红外光谱图分析亦得到同样结论，因此推测是EPS与Ni的络合效果相比于EDTA和NTA更有效，从而EPS对Ni生物利用度的提升更强，但这有待于后续实验的进一步验证。

　　为了评价不同条件下微生物群落的丰富度和多样性，对接种污泥、不补充Ni的对照组、Ni-1.25mg·L1组、EDTA、NTA、EPS-Ni-1.25mg·L1实验组的微生物群落进行α多样性分析，详细内容见表2。Ace和Chao指数主要用于评估微生物群落的丰富度，与接种泥相比，各实验组的Ace指数和Chao指数均明显减小，这表明随着发酵过程产酸细菌进行了富集；Shannon和Simpson指数主要反映群落多样性，2个指数反映的变化情况一致，即实验组群落多样性也表现出一定程度的降低。随着厌氧发酵的进行，产酸发酵体系对厌氧细菌进行了优化选择。其中，Ni单独补充比的Ace、Chao、Simpson指数高，Shannon指数低，这与韦采妮等的研究一致，表明添加Ni增加了厌氧发酵系统中微生物的物种丰富度和多样性。EDTA-Ni、NTA-Ni的物种丰富度和多样性高于对照组，但低于单独Ni补充组；而EPS-Ni组高于Ni-1.25mg·L1，这表明人工螯合剂会降低微生物数量与多样性，而EPS由于其绿色配体的特性，从而保障了产酸细菌的丰度和多样性，这与2.1.2部分中EPS-Ni实验组得到了最高的VFA产值结果相对应。

　　对微生物群落优势菌门和优势菌属的演替情况也进行了分析，如图7所示。在产酸发酵体系中，厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)都占据主导地位。Firmicutes在各组中的相对丰度最高，达到45%~60%，作为优势菌门在水解酸化过程中发挥着重要的作用：可以产生胞外酶，是分解纤维素、脂质和蛋白质等有机物生成小分子物质的主要菌类，也是产生VFA的高相对门，并且Firmicutes对极端环境的耐受性较强，能够适应不断酸化的环境，在VFA产量达到峰值，系统pH降低到4时仍保持高相对丰度，保障底物的水解酸化效果。Proteobacteria在添加Ni的实验组中，相对丰度由对照组的17.0%增加到23%~30%，这与CHAKRABORT等的研究一致。Bacteroidota中的大部分细菌参与水解酸化过程，能降解碳水化合物、蛋白质等多种有机物。

　　随着发酵的进行，各实验组的优势菌属与接种泥显现出巨大差异。接种泥中的优势菌属Fastidiosipila(24.6%)随着发酵的进行逐渐减少，在发酵后期相对丰度仅有0.05%~1.4%。对照组的优势菌属为Bacillus(26.1%)，该菌属在厌氧发酵体系中普遍存在，有助于碳水化合物的降解。单独加Ni-1.25mg·L1的实验组和EPS-Ni组优势菌属为Clostridium_sensu_stricto_1(23.1%，19.7%)，是水解酸化的重要细菌，可以利用多种糖作为碳和能源来产生乙酸、丁酸、氢气和二氧化碳，是丁酸发酵常见的优势菌种，本研究中乙酸和丁酸的大量存在证明了该菌属的存在。EDTA-Ni组、NTA-Ni组Clostridium_sensu_stricto_1(12.1%，21.0%)和Bacillus(12.6%，19.0%)丰度相差不大。除Clostridium_sensu_stricto_1和Bacillus外，各实验组的Fermentimonas相对丰度也较高，为8.1%~15.5%，是一种厌氧产乙酸菌，它能利用碳水化合物产生乙酸。总之，Ni的添加可以通过增加Clostridium_sensu_stricto_1的相对丰度来提高VFA(主要是丁酸)的产量，这与2.1.2部分的结论相对应，并且与Clostridium_sensu_stricto_1和Bacillus的相对丰度一致，乙酸和丁酸的产量EPS-Ni组NTA-Ni组EDTA-Ni组。但是EPS-Ni组的Clostridium_sensu_stricto_1和其他组相比不是丰度最高的，这是因为EPS能够在一定程度上保障产酸细菌的丰度，使得该组在发酵末期的群落多样性相比于其他组更高，从而导致单个属的丰度较小。不过和其他水解产酸菌属相比，Clostridium_sensu_stricto_1的丰度更高，这保障了乙酸和丁酸产量更高。

　　1)不同Ni质量浓度在FW产酸发酵过程中表现出明显的低促高抑现象，最优质量浓度和次优质量浓度分别为2.5mg·L1和1.25mg·L1。

　　3)发酵过程中Ni的化学形态分析表明，螯合剂的加入增加了Ni的F1和F2形态比例，EPS实验组最为明显，达到单独Ni的1.49倍，这表明螯合剂通过提高Ni的生物利用度强化了产酸效率。

　　4)对发酵体系中的微生物种群多样性和群落结构进行分析，表明Firmicutes和Clostridium_sensu_stricto_1是水解酸化中的优势门和优势属，Ni可以增加Clostridium_sensu_stricto_1的相对丰度，同时EPS能够保障产酸细菌的丰度从而提高VFA产量。因此，可以认为在FW产酸发酵体系中，EPS是减少Ni投加用量和强化水解产酸效能的绿色螯合剂。（来源：太原理工大学环境科学与工程学院，太原理工大学环保产业创新研究院）

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