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　　赭曲霉毒素A（OTA）是由黑曲霉、赭曲霉或石炭曲霉等真菌产生的次生代谢物，已被国际癌症研究机构列为2B类致癌物。饮食摄入是人们接触OTA的主要途径。生物解毒被认为是减少OTA污染的新策略。

　　近年来众多研究报道了酵母、芽孢杆菌和无毒真菌等能够通过细胞吸附或产酶降解OTA，而酶法降解OTA因其高效、便捷和不消耗食品本身营养物质而被广泛应用。然而大部分天然酶的本质是蛋白质，其结构并不稳定，通过将酶固定则可以解决这一问题。各种类型的材料，包括天然或合成聚合物和无机材料，以不同的方式用作酶固定的支持物。众多载体中，金属有机骨架（MOF）因孔径均匀、比表面积大、生物相容性良好的优点备受关注。MOF是由金属离子和有机配体（连接体）通过配位键连接而成的纳米晶体材料，在气体储存、药物输送、催化、传感等领域都有广阔的应用前景。Zn-MOF作为载体，可通过一步原位固定法实现酶负载，不仅能够节约合成时间，而且该方法条件温和、固定后的酶稳定性较好，因此可用于OTA降解酶的固定。

　　源自Aspergillus niger的脂肪酶A（ANL），可以通过水解破坏OTA的酰胺键将其转化为赭曲霉毒素

　　和苯丙氨酸。为提高ANL对OTA的降解效率， 西北农林科技大学葡萄酒学院的郇佳欣、黄燕萍、袁春龙*等 研究采用原位一步合成法将ANL负载到Zn-MOF上，制备Zn-MOF固定化脂肪酶（ANLZn-MOF），通过优化合成参数和系列表征技术探究ANLZn-MOF的物理化学特性，同时以OTA降解率为评价指标系统探究ANLZn-MOF对OTA的降解性能及其影响因素，明确ANLZn-MOF循环使用的稳定性，以期为酶法去除食品及饲料中的OTA提供新思路。

　　为了明确ANL负载后Zn-MOF的理化性质，采用多种表征手段系统探究了Zn-MOF和ANL

　　Zn-MOF的形貌、晶体结构、表面官能团和热稳定性。由图1a可知，Zn-MOF为板状且大小均匀。与Zn-MOF相比，由0.6 mg/mL ANL制备的ANLZn-MOF形状和大小略有变化，但仍为板状（图1b）。随着合成体系中ANL质量浓度的升高，仍然保持板状（图1c、d），说明在本实验条件下，Zn-MOF合成体系中ANL的添加量对Zn-MOF的形态基本无显著影响。

　　如图2a所示，Zn-MOF中的有机芳香配体在3 340～3 100、1 600～1 550、1 500～1 430 cm-1和900～700 cm-1处有明显的特征峰，其中3 319 cm-1处的峰是由于N—H的伸缩振动。1 558 cm-1和1 398 cm-1处的峰对应羧基的不对称和对称拉伸。1 431 cm-1处的小峰对应与Zn-MOF键合的去质子化羧酸离子；的红外光谱不仅存在Zn-MOF的特征峰，而且由于ANL的负载导致在3 319 cm-1处的特征吸收峰明显增强，说明成功合成。此外，与Zn-MOF相比，并未出现新的吸收峰，表明ANL是以物理吸附的方式固定于MOF之中。物理吸附的实现可能是因为具有较大的比表面积，为酶的物理固定提供了充足的吸附位点，且其表面存在羧基基团，这些羧基具有较强的极性，能够与酶分子通过氢键和静电相互作用，从而实现了ANL在Zn-MOF上的有效固定。通过对游离ANL和的蛋白质结构特征吸收峰分析可知，ANL在1 658 cm-1处的峰值是脂肪酶的α-螺旋结构导致酰胺I键的C＝O拉伸振动，而在1 658 cm-1处的峰值移至1 620 cm-1处，这可能是Zn-MOF多孔结构对ANL的束缚导致ANL的

　　-螺旋结构变为聚集链，且500～700 cm -1 酰胺带的峰强度增加进一步证明ANL成功固定于Zn-MOF中。

　　Zn-MOF和Zn-MOF的晶体特性，结果如图2b所示。Zn-MOF在10.7°、19.42°、24.06°、26.14°处有显著的特征衍射峰。同样，ANLZn-MOF也显示了Zn-MOF的特征衍射峰，说明Zn-MOF负载ANL前后的晶体结构未发生变化，由于脂肪酶负载到Zn-MOF中，部分衍射峰发生偏移。

　　Zn-MOF、Zn-MOF和ANL在30～700 ℃范围内的质量损失，结果如图2c、d所示。对于Zn-MOF而言，在100～160 ℃范围内观察到轻微（近3.38%）的质量损失，主要是Zn-MOF粉末中存在的游离水蒸发所致；在189～224 ℃范围内观察到2.15%的质量损失，这是由于与MOF结构紧密结合的水分蒸发；由于Zn-MOF的结构分解，在380～550 ℃范围内观察到较大的质量损失（近38.71%）。在ANLZn-MOF中同样发现，由于MOF和脂肪酶中水分子的损失，在110～180 ℃有相对较大的质量损失（近10.39%） ；由于脂肪酶的湮灭，ANLZn-MOF的质量损失始于270 ℃左右，一直持续到550 ℃ 。通过差热分析可知，在120～550 ℃范围内，ANLZn-MOF的质量损失率高于Zn-MOF，这种较大的质量损失是因为Zn-MOF中存在ANL，尤其在380 ℃时ANLZn-MOF的质量损失比Zn-MOF高约14.4%，这进一步证实了ANL成功固定在Zn-MOF中。

　　Zn-MOF合成时酶的添加量、合成时间及搅拌速率进行了优化，以OTA降解率确定ANLZn-MOF制备的工艺参数。如图3a所示，当ANL质量浓度为0.2～1.0 mg/mL时，Zn-MOF对ANL的固定率随酶质量浓度的升高呈先降低后升高的趋势，但当体系中ANL的质量浓度高于1.0 mg/mL时，Zn-MOF对ANL的固定率趋于平稳。当ANL质量浓度为1 mg/mL时，ANLZn-MOF对OTA的降解率最高，达到了69.9%。因此，确定在ANLZn-MOF制备过程中ANL的质量浓度为1 mg/mL。反应时间不仅影响ANL与Zn-MOF的相互作用，也对Zn-MOF晶体形成至关重要。如图3b所示，Zn-MOF对ANL的固定率和ANLZn-MOF对OTA的降解率随着合成时间的延长呈现先增大后减小的趋势。在合成时间为2 h时，ANLZn-MOF对OTA的降解率达到最高（71.8%），因此确定ANLZn-MOF的最佳合成时间为2 h。搅拌速率影响ANLZn-MOF合成体系中各物质之间的相互作用。由图3c可知，在400 r/min的搅拌条件下ANL的固定率最高，达到23.7%，且该条件下制备的ANLZn-MOF对OTA的降解率较高（73.0%）。因此，制备ANLZn-MOF的最佳条件为ANL质量浓度1.0 mg/mL、合成时间2 h、搅拌速率400 r/min，在该条件下酶载量可达155 mg/g。

　　Zn-MOF中ANL是否具有OTA降解能力，本实验以游离的ANL为对照，以ANL质量浓度和反应时间为变量，对比了ANL和ANLZn-MOF对OTA的降解效果。由图4可知，随着反应时间的延长，二者对OTA的降解率逐渐升高，说明Zn-MOF本身对ANL活性无影响；但在相同的ANL质量浓度条件下，ANLZn-MOF对OTA的降解率比ANL高。体系中添加的ANL质量浓度越大，OTA的降解率越高。对于游离的ANL而言，当其质量浓度为20、30 ng/mL时，经过24 h后其对OTA的降解率高达100%，而ANLZn-MOF中的ANL质量浓度为10 ng/mL即可在24 h内完全降解OTA，这表明经Zn-MOF固定后显著提高了ANL对OTA的降解能力，且在相同酶浓度下，ANLZn-MOF对OTA的降解能力更强，ANLZn-MOF（其中ANL质量浓度为20 ng/mL）能在8 h内完全降解OTA，比游离ANL完全降解OTA的时间缩短了66.7%，这可能是因为游离的酶分子在溶液中相比于固定酶更容易发生聚集现象，导致活性位点被遮蔽。而固定化可以将酶分子分散并固定在载体上，避免酶分子之间的相互聚集，保持了酶的活性。同时Zn-MOF可以为ANL提供一个相对稳定的微环境，保护ANL的活性结构，防止其在反应过程中发生变性或失活。这使得ANL能够保持较高的活性，持续有效地对OTA进行降解。

　　体系pH值的变化可以引起酶构象变化或底物电荷特性等性质的改变，对酶活性影响较大。由图5a可知，pH值对ANL

　　Zn-MOF和ANL的OTA降解能力具有显著影响，随着体系pH值的升高，二者的OTA降解率呈现先上升后下降的趋势，且当pH 7.0时OTA的降解率最高。而在偏酸性和碱性条件下，ANLZn-MOF和ANL的活性均降低。这可能是在较低或较高pH值条件下，由于ANL的变性或其构象改变削弱了活性位点与OTA的相互作用。此外，在酸性环境中ANLZn-MOF的OTA降解率略低于ANL，在碱性环境中ANLZn-MOF对OTA的降解率比ANL高出20%以上。这可能是由于NH 2 -BDC的羧基带负电荷，降低了ANL吸附位点周围的pH值，因此在反应体系pH值较高的情况下，ANLZn-MOF对OTA的降解率仍能保持较高的水平。这种将酶固定后导致其pH值最适区域向酸性或碱性方向转变的情况在其他酶中也观察到。

　　温度通过增加自由能水平从而降低或升高酶促反应的活化能，进而改变酶-底物复合物中的相互作用。由图5b可米乐（MILE）-官方首页知，随着温度由25 ℃升高至75 ℃，ANL

　　Zn-MOF和ANL对OTA降解率均呈现先升高后降低，且ANLZn-MOF的OTA降解率均高于ANL，尤其是在45 ℃条件下ANLZn-MOF对OTA的降解率高达73%。与ANL相比，ANLZn-MOF具有较好的热稳定性，在体系温度为65 ℃及以上时，ANLZn-MOF仍能够降解体系中的OTA，降解率高于30%。这可能是因为ANL负载在Zn-MOF后其三维构象更加稳定，从而防止其催化中心的变性。

　　在酶促反应的过程中，底物或酶分子中具有催化作用的氨基酸发生电离，而在离子强度不同的情况下，酶分子的氨基酸残基可能会发生质子化或去质子化反应，并影响底物的结合和转化。而且考虑到ANL特殊的作用机制，反应体系的离子强度会影响ANL活性中心的开放和关闭程度，因此本实验探究了体系中离子强度对ANL

　　Zn-MOF的OTA降解效果的影响，结果如图5c所示。随着磷酸盐缓冲液浓度的增加，ANLZn-MOF和ANL的OTA降解率均呈先升高后降低的趋势，这是因为高离子强度不利于ANL活性中心的暴露，从而影响ANLZn-MOF和ANL对OTA的降解能力。值得注意的是，在离子浓度高达24 mmol/L的条件下，ANLZn-MOF的OTA降解率比ANL高出20%左右。且ANLZn-MOF的OTA降解率始终高于ANL；当磷酸盐缓冲液浓度为12 mmol/L时，ANLZn-MOF的OTA降解率达到最高值，为74.8%，ANL的OTA降解率为40.0%。

　　由图5d可知，随着反应时间的延长，2 种反应体系（5、500 mL）下ANL

　　Zn-MOF对OTA的降解率均逐渐升高。在相同的时间条件下，5 mL反应体系的降解率始终高于500 mL反应体系。这表明反应体系体积对ANLZn-MOF降解OTA的效果有影响。在5 mL的反应体系中，ANLZn-MOF对OTA的降解率更高，可能是因为在较小的体系中底物和催化剂的分布相对更加均匀，分子间的有效碰撞几率更高，从而使得降解反应能够更快速有效地进行。而在较大的反应体系（500 mL）中，底物和催化剂的扩散相对较慢，可能导致局部浓度不均匀，影响了反应的进行速度和最终的降解效率。尽管如此，在较大的反应体系下ANLZn-MOF仍能在12 h内降解69.3%的OTA。同时，较小体系中OTA的降解率更高也可能是因为受外界干扰因素相对较少，有利于维持反应的高效进行。

　　固定化酶可以循环使用，且在循环使用的过程中能保持酶原有的催化性能，明确固定化酶的循环特性对其工业应用至关重要。如图5e所示，ANL

　　Zn-MOF对OTA的降解率在使用2 次后缓慢下降，在使用5 次后ANLZn-MOF仍能保留78%的相对活性。ANLZn-MOF的活性降低可能是由于ANL的分离和失活，以及离心和洗涤过程中固定化酶的损失。对重复使用5 次后ANLZn-MOF的形貌观察可知，ANLZn-MOF依然保持原来的板状（图5f），说明其具有较好的稳定性，能够根据需求循环使用。

　　为了解决ANL在降解OTA时存在的稳定性差和难以循环利用的难题，本实验通过一步原位固定法制备了ANL

　　Zn-MOF，其最优制备条件为酶质量浓度1 mg/mL、合成时间2 h、搅拌速率400 r/min，同时考察了不同pH值、温度、离子强度和反应体系体积条件下ANLZn-MOF对OTA的降解情况。结果表明，经Zn-MOF固定拓宽了ANL的温度使用范围，增强了其耐碱性，在pH＞7、温度高于65 ℃和离子浓度高达24 mmol/L的条件下，ANLZn-MOF的OTA降解率比ANL高出20%左右，在较大的反应体系下ANLZn-MOF仍能在12 h内降解69.3%的OTA。同时ANLZn-MOF具有较好的稳定性，循环使用5 次仍能保持其78%的OTA降解能力。本研究可为后续利用ANLZn-MOF降解食品体系中的OTA奠定基础。

　　本文《Zn-金属有机骨架固定脂肪酶及其对赭曲霉毒素A的高效降解》来源于《食品科学》2025年46卷第16期175-182页，作者：郇佳欣，黄燕萍，牛彦哲，宋宏，刘满顺，袁春龙*。DOI:10.7506/spkx1227-237。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

　　实习编辑：刘芯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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