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　　本发明涉及到生物遗传领域，具体涉及一种来源于深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21的具有宽广pH活性纤维素酶及其制备方法。

　　纤维素酶是一种由三种不同酶构成的复杂体系，具体分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及葡聚糖苷酶。微生物是纤维素酶的主要来源。真菌纤维素酶一般在酸性pH条件下具有生物活性，可应用于饲料行业、生物乙醇的生产等，但也有例外，一些真菌纤维素酶也可以在中碱性PH条件下具有纤维素酶活性，例如来源于特异腐质霉、热白丝菌的纤维素酶，具有生物石洗功能，达到起花作用，立体感强。由于中碱性纤维素酶受到越来越多 的关注，一些研究者集中于细菌纤维素酶的研究，比如，芽孢杆菌、链霉菌的一些纤维素酶最适pH为中碱性，能耐受较高的pH，其中芽孢杆菌碱性纤维素酶已经应用于洗涤剂行业，可以除去织物表面的纤维绒毛，让织物看起来艳丽，起到除旧返新的效果。有很多纤维素酶的基因被克隆了，由于细菌基因组中不含有内含子，能够快捷分离其纤维素酶基因，而相对于真菌纤维素酶的基因来说，要快速分离到其纤维素酶基因，难度相对来说更大，相关的专利也就较少，报道最多的是里氏木霉纤维素酶，它能协同水解纤维素，其效率较高，其中一些纤维素酶的表达已经在里氏木霉得到加强，如内切纤维素酶。在这里，我们通过现代生物信息学技术，得到一种新颖的具有宽广PH活性纤维素酶的基因编码区DNA及其多肽。虽然现有背景技术中存在涉及到上述的一些或者所有性质的纤维素酶，但是还是要需要具有新的广谱PH的纤维素酶，而此纤维素酶在生物石洗、织物抛光、纸桨处理以及生物质的转变是很有用的。

　　本发明的目的就是为了解决上述现有技术存在的问题，提供一种具有宽广pH活性纤维素酶及其制备方法。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案一种具有宽广PH活性纤维素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。上述具有宽广pH活性纤维素酶基因，其中，所述的纤维素酶基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述纤维素酶基因的编码多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述编码多肽，其中，所述的编码多肽在pH6-10条件下具有75%以上的纤维素酶相对活性，并且能在PH3-10保存下具有90%以上的残余相对活性。一种具有宽广pH活性纤维素酶的制备方法，包括以下步骤I)由深海真菌Phaeosphaeria sp. LH21培养分离出具有宽广pH活性纤维素酶基因，该基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；2)将基因克隆到表达载体PPIC9K中；

　　3)将构建的表达载体转入到宿主细胞，生产具有宽广pH活性纤维素酶的基因工程菌；4)培养基因工程菌，获得具有宽广pH活性纤维素酶。上述具有宽广pH活性纤维素酶的制备方法，其中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、或分支杆菌；真核细胞包括酵母细胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各种动植物细胞。本发明以来源于深海真菌Phaeosphaeria sp. LH21的基因组为基础,利用同源性搜索得到保守性氨基酸片段，设计简并性引物得到中间序列，用基因组走读扩增两端未知序列，反转录PCR扩增该基因，然后克隆到表达载体PPIC9K中，并在毕赤酵母GSl 15中获得表达。通过Genbank同源搜索和蛋白质功能鉴定研究表明，该基因的编码区DNA是一个编码纤维素酶的DNA序列。该基因能在任何宿主细胞中表达，表达的纤维素酶在PH6-10条件下具有75%以上的纤维素酶相对活性，此纤维素酶还能在pH3-10条件下能保持残余相对 纤维酶活性90%以上。另外，本发明还提供了在宽广pH条件下具有最佳纤维素酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同突变体。在本发明中，编码的纤维素酶在pH6-10条件下可以表现出75%以上的相对活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. I的核苷酸序列及其简并密码子所产生的序列。由已知密码子的简并性，与SEQ ID NO. I核苷酸序列同源性小于70%的简并序列也能编码出SEQID NO. 2所述的氨基酸序列，还包括核苷酸杂交的核苷酸序列。还可包括同源性至少70%的核苷酸序列。在本发明中，“宽广pH活性纤维素酶”，指在pH6-10条件下可以表现出75%以上的纤维素酶活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽，它在各种pH条件下米乐登录入口的耐受性可以达到90%以上。该术语还包括SEQ ID NO. 2序列的突变体，这些突变体具有与天然中碱性纤维素酶相同的功能。这些突变体包括若干个氨基酸的缺失，插入和/或取代，以及在两端添加一个、数个或一段氨基酸序列，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异。例如，用性能相近或相似的氨基酸取代，一般不会改变蛋白质的生物功能。又比如，在两端添加一个、若干个或一段氨基酸序列也不影响酶的功能。该术语还包括宽广PH活性纤维素酶的活性片段和活性衍生物。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，可以是市场上销售的质粒。在生产本发明的具有宽广PH活性纤维素酶时，可以将具有宽广pH活性纤维素酶基因的编码区DNA序列连接于表达调控序列，从而形成具有宽广PH活性的纤维素酶表达载体。表达载体含有复制起始点、启动子、增强子和必要的加工信息位点。表达载体还必须含有标记基因，比如提供卡那霉素，氨苄表霉素，氨甲蝶呤等抗生素或其他毒性物质的抗性蛋白质；互补营养缺陷型蛋白质；提供复合培养基中没有的必需营养成分的蛋白质。在本发明中，宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞如大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、分支杆菌等。常用的真核细胞如酵母细胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉等，或各种动植物细胞。本发明的具有宽广pH活性纤维素酶基因或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，用本领域技术人员已知的常规方法制备，以Phaeosphaeria sp.全基因组DNA为模板，扩增而得到相关基因。当获得相关基因时，就可将其克隆至相关载体，再转入宿主细胞，然后通过常规方法从扩繁后的宿主细胞中得到大批量的相关基因。

　　具体实施例方式下面通过实施例对本发明作详细描述I)具有宽广pH活性纤维素酶基因的克隆首先培养Phaeosphaeria sp. LH21,培养方法按PDA的培养基，按Sambrook等的方法提取基因组DNA。根据P.nodorum SN15基因组测序信息，以其基因登录号NW_001884567的序列进行同源搜索，找出保守的同源片段，设计简并性引物5’ -TACTGGGAYTGCTGYAARGG-3’ 和 5’ -GCCTTSARCTTCKCGGGGAA-3’，扩增中间序列，通过三轮 的基因走读，扩增两侧未知序列，拼接全长序列，通过ORFfinder软件预测开放阅读框，经反转录PCR扩增到了预计的目的片段，验证是正确的。2)具有宽广pH活性纤维素酶的制备上述获得的具有宽广pH活性纤维素酶基因通过SignalP3. O软件预测信号肽，去除信号肽，在上游引物引入Not I位点，下游引物引入EcoR I，插入到pPIC9K中，再电转到毕赤酵母GS115中，筛选能够表达具有宽广pH活性纤维素酶的基因工程菌。具体操作如下a、挑取具有宽广pH活性纤维素酶基因的阳性基因工程菌的单克隆，接种至25mlBMGY 中(250ml 摇瓶)，28°C，250rpm,大约 18h。b、室温3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至100ml，进行诱

　　导表达。C、在IL摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。d、每24小时，加甲醇至终浓度为O. 5%以继续诱导。e、以CMC为底物，在50°C、各种pH条件下通过DNS法测定纤维素酶相对活性，以发现最适pH值。f、在50°C、各种pH条件孵育I小时后，以CMC为底物，在50°C、pH8条件下通过DNS法测定纤维素酶残余相对活性，以发现PH值耐受性。序列表〈110〉华东理工大学120具有宽广pH活性纤维素酶及其制备方法1602170Patent In version 3. 3〈210〉I211702212DNA〈213〉暗球腔菌 LH21 (Phaeosphaeria sp. LH21)〈400〉I

　　1.一种具有宽广pH活性纤维素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。

　　2.根据权利要求I所述具有宽广PH活性纤维素酶基因，其特征在于所述的纤维素酶基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

　　3.一种根据权利要求I所述的纤维素酶基因的编码多肽，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。

　　4.根据权利要求3所述的编码多肽，其特征在于所述的编码多肽在PH6-10条件下具有75%以上的纤维素酶相对活性，并且能在pH3-10保存下具有90%以上的残余相对活性。

　　5.一种具有宽广pH活性纤维素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)由深海真菌Phaeosphaeriasp. LH21培养分离出具有宽广pH活性纤维素酶基因，该基因具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列； 2)将基因克隆到表达载体PPIC9K中； 3)将构建的表达载体转入到宿主细胞，生产具有宽广pH活性纤维素酶的基因工程菌； 4)培养基因工程菌，获得具有宽广pH活性纤维素酶。

　　6.根据权利要求5所述具有宽广pH活性纤维素酶的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、或分支杆菌；真核细胞包括酵母细胞、里氏木霉、黑曲霉、米曲霉或各种动植物细胞。

　　一种具有宽广pH活性纤维素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述纤维素酶基因的编码多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明以Phaeosphaeria sp.LH21基因组为基础，通过基因组走读和反转录PCR扩增到此纤维素酶基因。此基因及米乐登录入口其突变体能与表达载体连接，转入到任何宿主细胞中产生纤维素酶，以CMC为底物，在pH6-10、50℃条件下具有75％以上的相对活性，并且能在pH3-10保存下具有90％上以的残余相对活性。本发明中的宽广pH活性纤维素酶在洗衣涤剂行业、食品行业、纺织行业、石油化工、医药生产和饲料加工等领域具有广阔的应用前景。

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